貴州大學發現首個抗植物病毒相分離抑制劑

　　12月23日，貴州大學綠色農藥全國重點實驗室博士生王艷菊在Aggregate(影響因子IF=13.9)期刊發表了題為“A Vanillin‐Derived Inhibitor of Aggregates via Targeting Intrinsically Disordered Regions of Phytoviral Nucleocapsid Protein”的研究論文，揭示了香草醛衍生物29通過結合番茄斑萎病毒核衣殼蛋白(TSWV NP)直接干擾相分離(PS)發生，抑制凝聚體而降低其致病性的機制。

　　番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus，TSWV)是一種三分體負義鏈RNA病毒,被認為是最具毀滅性的植物病毒之一。目前，用于防治TSWV的化學藥劑可用抗病毒劑種類較少，且對不同病毒之間的防效差異較大。因此，發掘新型高效且作用機制獨特的抗TSWV小分子對保障糧食安全具有重要意義。

　　相分離(PS)已成為各種病毒生命周期中的重要機制，在許多情況下，PS促進宿主細胞內無膜細胞器或生物分子聚集體的形成，這些細胞器可以作為病毒復制、轉錄和組裝的樞紐。TSWV復制主要依賴于核糖核蛋白復合物(RNP)，其可以被認為是一種聚集體，它們的形成對于病毒的生命周期至關重要。因此，破壞RNP的形成或抑制TSWV復制并控制植物病害。鑒于RNPs的形成可能涉及TSWV NP的PS，如果能發現阻礙PS發生的抑制劑去干擾凝聚體RNP的形成，則有望控制TSWV在植物體內的增殖。目前在農業領域仍未見任何涉及小分子直接干擾PS發生并抑制凝聚體形成的報道。

圖1 化合物29抑制TSWV增殖的可能作用機制模式圖

　　作者通過簡潔高效的5步取代反應合成了一系列香草醛衍生物，并通過半葉枯斑法測試了所有目標化合物的抗TSWV活性，其中，化合物29抗TSWV的鈍化活性EC??為154.8μg/mL，優于商品藥劑利巴韋林ribavirin(701.9 μg/mL)，表明化合物29可能作為一種潛在的抗TSWV小分子。化合物29與TSWV NP的分子對接表明，TSWV NP^K68、TSWV NP^T92和TSWV NP^R94可能是化合物29作用于TSWV NP的潛在靶標位點。作者通過原核誘導表達純化了野生型TSWV NP和突變型TSWV NP，通過生物膜層干涉分析測試了化合物29與兩種蛋白的結合力，體外驗證氨基酸位點作為潛在靶點的可能性。此外，通過同源重組法構建了突變的侵染性克隆TSWV^K68A、TSWV^T92A、TSWV^R94A、TSWV^K68AT92AR94A和TSWV^K68GT92GR94G，體內驗證氨基酸位點作為潛在靶點的可能性。結果表明，單個氨基酸位點的突變對TSWV的侵染有一定的影響，但是只有三個氨基酸位點同時突變為丙氨酸(TSWV^K68AT92AR94A)時對TSWV的侵染影響更大。

　　以前的研究已經表明TSWV的侵染與寄主蛋白之間的密切聯系，為了探索與TSWV NP相互作用的潛在寄主蛋白，作者采用了免疫沉淀與質譜聯用，并通過Y2H、BiFC和LCA驗證TSWV NP與寄主蛋白的互作，發現一種寄主蛋白GTP結合核蛋白(NbRANL)能夠與TSWV NP相互作用(圖2)。通過轉錄組學、瞬時過表達和Craspr-cas9基因敲除等驗證表明NbRANL在TSWV的侵染中起著正向調控的作用。此外，作者還發現NP能夠在體內通過相分離形成凝聚體(圖3)，同時NbRANL能夠促進TSWV NP凝聚體的形成。

圖2 Y2H、BiFC和LCA驗證TSWV NP和NP^K68AT92AR94A與NbRANL的相互作用。

圖3 PS誘導NP凝聚體的形成

　　綜上，該研究表明香草醛衍生物29通過結合TSWV NP的氨基酸位點，影響NP發生相分離形成凝聚體，同時發現寄主互作因子NbRANL能夠促進NP形成凝聚體，為TSWV抗病毒藥劑的發現及作用機制研究奠定了基礎。此工作部分結果近期發表于Aggregate上(https://doi.org/10.1002/agt2.725)。貴州大學綠色農藥全國重點實驗室2019級農藥學專業博士生王艷菊為論文第一作者，宋寶安、宋潤江和俞露為該論文共同通訊作者。本研究得到國家自然科學基金(32330087，32302388)和科技攻關計劃資助貴州省科研創新團隊項目(2017-5788-1)和貴州大學科研創新團隊項目(202403)的支持。